A_pan-coronavirus_fusion_inhibitor_targeting_the_H.pdf

Stiamo esaminando se esistano “inibitori” al virus detto coronavirus.

Secondo la fonte seguente: (visione tv)
titolo:

Nel 2019 esisteva già un antidoto per il Sars-cov 2?

link:
https://visionetv.it/nel-2019-esisteva-gia-un-antidoto-per-il-sars-cov-2/

Esiste un documento. cito “articoli peer-reviewed  nell’aprile del 2019.”

Tuttavia si cita solo il titolo del documento e cioé “A_pan-coronavirus_fusion_inhibitor_targeting_the_H.pdf” ma non se ne consente il download.

Grazie alla “fonte primaria”:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30989115/

A destra trovate PMC full txt (free) ..

Abbiamo eseguito, allora, noi una ricerca del documento e lo abbiamo trovato al link seguente, grazie alla “fonte primaria” appena sopra riportata:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6457931/

In particolare alla pagina citata in alto a destra c’è scritto “OTHER FORMATS” e subito sotto:
PDF (5.2M)

Grazie a ciò lo abbiamo scaricato e messo in download diretto, anche dal blog attuale, al seguente link:
A_pan-coronavirus

Dunque si tratta di esaminare il documento e vedere se contiene informazioni degne di nota ..

Il nostro esame: (il testo in inglese e poi in italiano) ..

Si troverà che “L’ANTIDOTO” ESISTEVA GIA’ NEL 2019 DATA DELL’ARTICOLO.
Il nome dell’antidoto è EK1.

(1)

Continuously emerging highly pathogenic human coronaviruses (HCoVs) remain a major threat to human health,
as illustrated in past SARS-CoV and MERS-CoV outbreaks. The development of a drug with broad-spectrum HCoV
inhibitory activity would address this urgent unmet medical need. Although previous studies have suggested that
the HR1 of HCoV spike (S) protein is an important target site for inhibition against specific HCoVs, whether this
conserved region could serve as a target for the development of broad-spectrum pan-CoV inhibitor remains controversial. Here, we found that peptide OC43-HR2P, derived from the HR2 domain of HCoV-OC43, exhibited broad
fusion inhibitory activity against multiple HCoVs. EK1, the optimized form of OC43-HR2P, showed substantially improved pan-CoV fusion inhibitory activity and pharmaceutical properties. Crystal structures indicated that EK1 can
form a stable six-helix bundle structure with both short -HCoV and long -HCoV HR1s, further supporting the
role of HR1 region as a viable pan-CoV target site

traduzione di (1):

I coronavirus umani altamente patogeni continuamente emergenti (HCoV: ndr: H sta per human) rimangono una grande minaccia per la salute umana,
come illustrato nelle passate epidemie di SARS-CoV e MERS-CoV. Lo sviluppo di un farmaco con attività inibitoria dell’HCoV ad ampio spettro
ad ampio spettro affronterebbe questo urgente bisogno medico insoddisfatto. Anche se studi precedenti hanno suggerito che
l’HR1 della proteina spike (S) dell’HCoV è un importante sito bersaglio per l’inibizione contro specifici HCoV, se questa
regione conservata potrebbe servire come bersaglio per lo sviluppo di un inibitore pan-CoV ad ampio spettro rimane controverso. Qui abbiamo scoperto che il peptide OC43-HR2P, derivato dal dominio HR2 di HCoV-OC43, ha mostrato un’ampia
attività inibitoria contro più HCoV. EK1, la forma ottimizzata di OC43-HR2P, ha mostrato un’attività inibitoria di fusione pan-CoV e proprietà farmaceutiche sostanzialmente migliorate. Le strutture di cristallo hanno indicato che EK1 può
formare una struttura stabile a sei eliche con entrambe le HR1 corte -HCoV e lunghe -HCoV, sostenendo ulteriormente il
il ruolo della regione HR1 come un sito bersaglio valido per il Pan-CoV

Commento:
per ora si sono forniti solo nomi di identificazione e non dettagli.

(2)

INTRODUCTION
Coronaviruses (CoVs) are enveloped viruses with a positive-sense,
single-stranded RNA and are associated with various natural hosts.
CoVs are divided into alpha, beta, gamma, and delta groups, and
the beta group is further composed of A, B, C, and D subgroups
(Fig. 1A) (1). Among them, six CoVs can infect humans (HCoVs),
including HCoV-229E (229E) and HCoV-NL63 (NL63) in the alpha
group, HCoV-OC43 (OC43) and HCoV-HKU1 (HKU1) in beta
subgroup A, severe acute respiratory syndrome CoV (SARS-CoV)
in beta subgroup B, and Middle East respiratory syndrome CoV
(MERS-CoV) in beta subgroup C (2).
In this century, SARS-CoV and MERS-CoV have emerged in the
human population and caused severe pulmonary disease with
alarmingly high case-fatality rates. In 2002, SARS-CoV infections
first appeared in China and then quickly spread as a global epidemic
in more than 30 countries with 8273 infections and 775 deaths (nearly
10% mortality) (2). In 2012, MERS-CoV emerged in Saudi Arabia
and spread throughout the Middle East. In 2015, the second pandemic
of MERS-CoV occurred in South Korea, causing super-spreading
events with third- and fourth-generation cases of infection. The
World Health Organization has reported 2229 laboratory-confirmed
cases of MERS-CoV infection, including 791 deaths (about 35% case

traduzione di (2):

INTRODUZIONE
I coronavirus (CoV) sono virus inviluppati con un RNA a senso positivo,
RNA a singolo filamento e sono associati a vari ospiti naturali.
I CoV sono divisi nei gruppi alfa, beta, gamma e delta, e
il gruppo beta è ulteriormente composto da sottogruppi A, B, C e D
(Fig. 1A) (1). Tra questi, sei CoV possono infettare gli esseri umani (HCoV),
compresi HCoV-229E (229E) e HCoV-NL63 (NL63) nel gruppo alfa
gruppo, HCoV-OC43 (OC43) e HCoV-HKU1 (HKU1) nel beta
sottogruppo A, sindrome respiratoria acuta grave CoV (SARS-CoV)
nel sottogruppo beta B, e la sindrome respiratoria mediorientale CoV
(MERS-CoV) nel sottogruppo beta C (2).
In questo secolo, SARS-CoV e MERS-CoV sono emersi nella
popolazione umana e hanno causato gravi malattie polmonari con
allarmanti tassi di mortalità. Nel 2002, le infezioni da SARS-CoV
sono apparse per la prima volta in Cina e poi si sono rapidamente diffuse come un’epidemia globale
in più di 30 paesi con 8273 infezioni e 775 morti (quasi
10% di mortalità) (2). Nel 2012, MERS-CoV è emerso in Arabia Saudita
e si è diffuso in tutto il Medio Oriente. Nel 2015, la seconda pandemia
di MERS-CoV si è verificata in Corea del Sud, causando super-spreading
eventi con casi di infezione di terza e quarta generazione. Il
Organizzazione Mondiale della Sanità ha riportato 2229 casi confermati in laboratorio
casi di infezione da MERS-CoV, compresi 791 morti (circa il 35% dei casi

Commento su (2)

Informazioni importanti per constatare come la epidenia da corona virus fosse un fenomeno studiato da almeno 20 anni e non è un fenomeno che compare nel 2020. Sebbene -quindi- esistessero questi studi .. la strategia del ministero della sanità in Italia prescriveva .. “tachipirina e vigile attesa”. Questa procedura -quindi-  è stata una *scelta politica del governo italiano* (e del suo Comitato Scientifico)  che ha impedito di agire subito rinviando a protocolli di emergenza .. e di consigliare la respirazione forzata detta “ventilazione” che ha *peggiorato le condizioni cliniche* .. quando non si fossero somministrati *preventivamente* “anticoagulanti” per impedire la trombosi a livello dei polmoni.

(3)

fatality) in 27 countries as of August 2018 (www.who.int/emergencies/
mers-cov/en/). Meanwhile, the remaining common HCoVs, such as
229E, OC43, and NL63, usually infect the human upper respiratory
tract and cause the common cold, but they also are responsible for
severe and even fatal diseases in children, elderly, and immunocompromised patients (3–5). These scenarios suggest that those
common HCoVs might also pose a lethal threat to humans. Note
that HCoVs are rapidly evolving. OC43 isolates with novel genomes
are being continuously identified (6–8).
The existence of SARS-like CoV (SL-CoV) and MERS-like CoV
(ML-CoV) also pose great threats to public health worldwide. Recent studies identified some types of SL-CoV, such as SL-WIV1-CoV
and SL-SHC014-CoV, whose spike (S) proteins highly resemble those
of SARS-CoV. These SL-CoVs could use the same SARS-CoV receptor, i.e., angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2), to directly enter
permissive human cells without need for adaptation (9–11). In addition, the ML-CoV, Tylonycteris bat CoV HKU4, was shown to recognize the MERS-CoV receptor CD26 and infect human cells either after
introduction of two single mutations (S746R and N762A) into its S
protein or with the help of exogenous protease (12, 13). From a historical perspective, zoonotic CoVs harbor a strong ability to cross species
barriers to infect humans rapidly and unpredictably, as illustrated by
newly emerging HCoVs (2, 14). Thus, developing a specific drug that
only targets a single HCoV would be ineffective against newly emerging HCoVs (9–11). Since no broad-spectrum anti-HCoV drug is currently available for clinical use, it is incumbent to search for a common
or conserved target site based on existing HCoVs.
The S glycoprotein is a type I transmembrane glycoprotein that
plays an important role in mediating viral infection and is common
to all HCoVs. The S proteins consist of two subunits, S1 and S2
(Fig. 1B). The S1 subunit binds the cellular receptor through its
receptor-binding domain (RBD), followed by conformational changes
in the S2 subunit, which allows the fusion peptide to insert into the
host target cell membrane. The heptad repeat 1 (HR1) region in
the S2 subunit forms a homotrimeric assembly, which exposes
three highly conserved hydrophobic grooves on the surface that

traduzione di (3)

fatalità) in 27 paesi ad agosto 2018 (www.who.int/emergencies/
mers-cov/it/). Nel frattempo, i rimanenti HCoV comuni, come
229E, OC43 e NL63, di solito infettano il tratto respiratorio superiore
e causano il comune raffreddore, ma sono anche responsabili di
malattie gravi e persino mortali nei bambini, negli anziani e nei pazienti immunocompromessi (3-5). Questi scenari suggeriscono che questi
comuni HCoV potrebbero anche costituire una minaccia letale per gli esseri umani. Si noti
che gli HCoV sono in rapida evoluzione. Gli isolati OC43 con nuovi genomi
vengono continuamente identificati (6-8).
L’esistenza di CoV simili alla SARS (SL-CoV) e CoV simili alla MERS
(ML-CoV) rappresentano anche grandi minacce per la salute pubblica mondiale. Studi recenti hanno identificato alcuni tipi di SL-CoV, come SL-WIV1-CoV
e SL-SHC014-CoV, le cui proteine spike (S) assomigliano molto a quelle
della SARS-CoV. Questi SL-CoV potrebbero usare lo stesso recettore di SARS-CoV, cioè l’enzima di conversione dell’angiotensina-2 (ACE2), per entrare direttamente nelle cellule umane permissive senza bisogno di un’iniezione.
nelle cellule umane permissive senza bisogno di adattamento (9-11). Inoltre, il ML-CoV, Tylonycteris bat CoV HKU4, ha dimostrato di riconoscere il recettore CD26 del MERS-CoV e di infettare le cellule umane sia dopo
introduzione di due singole mutazioni (S746R e N762A) nella sua proteina S
o con l’aiuto di una proteasi esogena (12, 13). Da una prospettiva storica, i CoV zoonotici hanno una forte capacità di attraversare le barriere di specie
per infettare gli esseri umani in modo rapido e imprevedibile, come illustrato da
dai nuovi HCoV emergenti (2, 14). Quindi, lo sviluppo di un farmaco specifico che
solo contro un singolo HCoV sarebbe inefficace contro i nuovi HCoV emergenti (9-11). Dato che nessun farmaco anti-HCoV ad ampio spettro è attualmente disponibile per l’uso clinico, è necessario cercare un sito bersaglio comune
comune o conservato basato sugli HCoV esistenti.
La glicoproteina S è una glicoproteina transmembrana di tipo I che
gioca un ruolo importante nel mediare l’infezione virale ed è comune
a tutti gli HCoV. Le proteine S consistono di due subunità, S1 e S2
(Fig. 1B). La subunità S1 si lega al recettore cellulare attraverso il suo
dominio di legame al recettore (RBD), seguito da cambiamenti conformazionali
nella subunità S2, che permette al peptide di fusione di inserirsi nella
membrana della cellula bersaglio dell’ospite. La regione dell’eptad ripetizione 1 (HR1) nella
la subunità S2 forma un assemblaggio omotrimerico, che espone
tre scanalature idrofobiche altamente conservate sulla superficie che

Commento su (3)

Sta riconfermando, per ora, la possibilità di usare la proteina spike come metodo ipotetico di istruire il sistema immunitario a riconoscere i corona virus. Tuttavia la sovraproduzione di spike nella sperimentazione in corso dal 2020 ha mostrato la produzione di gravi “effetti avversi” come la sindrome ADE.

(4) (siamo a pagina 2 del file originale)

bind heptad repeat 2 (HR2). This six-helix bundle (6-HB) core structure
is formed during the fusion process and helps bring the viral and
cellular membranes into close proximity for viral fusion and entry
(Fig. 1B) (15). Thus, the S protein is an important target protein for
the development of specific drugs. In particular, the S1 RBD is a very
good target site, and both RBD-specific antibodies and RBD-based
vaccines have previously exhibited effective antiviral activity or protective effect in blocking binding of virus to host receptors (16). However, from an evolutionary perspective, the RBD of CoV is part of a
highly mutable region and, thus, is not an ideal target site for broadspectrum antiviral inhibitor development (14). The SARS-CoV RBDspecific antibody fm6 failed to block infection mediated by the S protein
of SL-CoV–SHC014 (9–11, 17). In contrast, the HR region in the
S2 subunit is conserved among various HCoVs and plays a pivotal
role in HCoV infections by forming the 6-HB that mediates viral
fusion (fig. S1A). Furthermore, the mode of interaction between
HR1 and HR2 is conserved among CoVs such that residues located at the “e” and “g” positions in the HR1 helices interact with residues
at the “a” and “d” positions in the HR2 helices (fig. S1B) (18). Previous studies have reported that peptides derived from the HR2 (or
C-terminal HR) region of class I viral fusion proteins from some enveloped viruses, including HIV-1 (19–21), respiratory syncytial virus
(RSV) (22), Ebola virus (23), paramyxoviruses SV5 (24), Nipah
virus (25), and murine hepatitis virus (MHV) (26), could competitively bind the viral HR1 (or N-terminal HR) and effectively inhibit viral infection. Therefore, it is reasonable to speculate that HR1
could also be a good target for the development of fusion inhibitors
against highly pathogenic HCoVs.
We and others have reported that peptides derived from the
HR2 regions of SARS-CoV and MERS-CoV S proteins can competitively inhibit viral 6-HB formation, thereby preventing viral fusion and
entry into host cells (18, 27). For example, the peptide CP-1, derived
from the SARS-CoV spike protein HR2 region, was able to inhibit SARS-CoV entry in a manner similar to that of MERS-HR2P

traduzione di (4):

legano la ripetizione heptad 2 (HR2). Questa struttura del nucleo a sei eliche (6-HB)
si forma durante il processo di fusione e aiuta a portare la membrana virale e
membrane cellulari in stretta vicinanza per la fusione e l’entrata virale
(Fig. 1B) (15). Quindi, la proteina S (spike) è un’importante proteina bersaglio per
lo sviluppo di farmaci specifici. In particolare, la RBD S1 è un ottimo
buon sito bersaglio, ed entrambi gli anticorpi specifici RBD e i vaccini basati su RBD
hanno precedentemente mostrato un’efficace attività antivirale o un effetto protettivo nel bloccare il legame del virus ai recettori dell’ospite (16). Tuttavia, da una prospettiva evolutiva, la RBD del CoV è parte di una
regione altamente mutevole e, quindi, non è un sito bersaglio ideale per lo sviluppo di inibitori antivirali ad ampio spettro (14). L’anticorpo specifico per la RBD del SARS-CoV fm6 non è riuscito a bloccare l’infezione mediata dalla proteina S
di SL-CoV-SHC014 (9-11, 17). Al contrario, la regione HR nella subunità
S2 è conservata tra vari HCoV e gioca un ruolo fondamentale
ruolo fondamentale nelle infezioni da HCoV formando la 6-HB che media la fusione
fusione virale (fig. S1A). Inoltre, il modo di interazione tra
HR1 e HR2 è conservato tra i CoV in modo tale che i residui situati nelle posizioni “e” e “g” nelle eliche HR1 interagiscono con i residui
nelle posizioni “a” e “d” delle eliche HR2 (fig. S1B) (18). Studi precedenti hanno riportato che i peptidi derivati dalla regione HR2 (o
C-terminale HR) regione di classe I proteine di fusione virale da alcuni virus avvolti, tra cui HIV-1 (19-21), virus respiratorio sinciziale
(RSV) (22), virus Ebola (23), paramyxovirus SV5 (24), Nipah
(25), e il virus dell’epatite murina (MHV) (26), potrebbero legare competitivamente l’HR1 virale (o HR N-terminale) e inibire efficacemente l’infezione virale. Pertanto, è ragionevole ipotizzare che HR1
potrebbe anche essere un buon bersaglio per lo sviluppo di inibitori della fusione
contro gli HCoV altamente patogeni.
Noi e altri abbiamo riportato che i peptidi derivati dalle regioni
HR2 delle proteine S di SARS-CoV e MERS-CoV possono inibire competitivamente la formazione di 6-HB virale, impedendo così la fusione virale e l’ingresso nelle cellule dell’ospite (18, 27).
ingresso nelle cellule dell’ospite (18, 27). Per esempio, il peptide CP-1, derivato
dalla regione HR2 della proteina spike di SARS-CoV, è stato in grado di inibire l’ingresso di SARS-CoV in modo simile a quello di MERS-HR2P

Commento su (4)

Non si capisce -allora- perché i cosiddetti vaccini (farmaci sperimentali) sono stati strutturati sulla proteina spike, anziché sull’inibitore HR1.

(5) (siamo a pagina 3 del doc originale):

RESULTS
HR-derived peptides inhibit cell-cell fusion mediated by S
proteins of multiple HCoVs
On the basis of the 6-HB fusion core structure, we previously reported on peptides MERS-HR1P and MERS-HR2P that were derived
from MERS-CoV HR1 and HR2, respectively (fig. S1C), and these
two peptides displayed good interaction with each other (27). Here,
we located the conserved HR region of multiple HCoVs by sequence
comparisons and then synthesized HR1- and HR2-derived peptides,
termed HR1P and HR2P (Fig. 1C). Notably, we observed 14–amino
acid insertions in both HR1P and HR2P in the HRs of two -HCoVs,
i.e., 229E and NL63.
To systematically assess the inhibitory activities of these peptides
against different HCoVs, we developed multiple cell-cell fusion
assays that were mediated by the S protein of various HCoVs (fig.
S1D). Consistent with previous results, MERS-HR2P had inhibitory
activity against cell-cell fusion mediated by MERS-CoV S protein
with a concentration for 50% inhibition (IC50) of 1.01 M, whereas
it showed little inhibitory activity in other HCoV S-mediated cellcell fusion assays even with concentrations up to 5 M (Fig. 1D and
table S1). Similarly, SARS-HR2P specifically inhibited SARS-CoV
S-mediated cell-cell fusion with an IC50 of 0.52 M. On the other
hand, HR2P peptides derived from the two -HCoVs, i.e., 229E and
NL63, showed potent and broad inhibitory activity against -HCoV
S-mediated cell-cell fusion with IC50 values ranging from 0.13 to
0.51 M or from 0.21 to 0.56 M, respectively, but no effective
inhibitory activity against -HCoVs (including MERS-CoV,
SARS-CoV, and OC43) S-mediated fusion (Fig. 1D and table S1).
OC43-HR2P exhibited broad and potent fusion inhibitory activity
with IC50 values of 0.39, 0.54, and 0.66 M against MERS-CoV,
SARS-CoV, and OC43, respectively (Fig. 1D and table S1). Unexpectedly, OC43-HR2P, a -HCoV HR2-derived peptide, and thus
14 residues shorter than 229E-HR2P and NL63-HR2P, exhibited
effective activity against -HCoVs with an IC50 of 0.84 M on
229E-S–mediated cell-cell fusion and an IC50 of 0.94 M on NL63-S–ediated cell-cell fusion. Among all HR1Ps, only 229E-HR1P exhibited moderate inhibitory effects on 229E-S– and NL63-S–mediated
cell-cell fusion (Fig. 1D). Thus, compared to HR1Ps, all HCoV
HR2-derived peptides exhibited excellent self-specific fusion inhibitory activity, whereas OC43-HR2P showed broad-spectrum
and potent fusion inhibitory activity against both -HCoV and
-HCoV S-mediated cell-cell fusion (Fig. 1D and table S1). We also
measured the -helicity of OC43-HR2P and HCoV-HR1Ps by circular dichroism and found that the peptides alone exhibited limited
-helicity ranging from 11.3 to 42.3% (fig. S1E). In contrast, the
mixtures of OC43-HR2P and each of these HR1 peptides, respectively, exhibited high -helicity (70.9 to 86.7%) with melting transition temperature (Tm) values that ranged from 48.5° to 91.5°C
(fig. S1E), further implying that OC43-HR2P can bind HR1s of
different HCoVs and form stable complexes, thereby blocking
S protein–mediated fusion.

traduzione su (5)

RISULTATI
I peptidi derivati dall’HR inibiscono la fusione cellula-cellula mediata dalle proteine S
di più HCoV
Sulla base della struttura del nucleo di fusione 6-HB, abbiamo precedentemente riportato i peptidi MERS-HR1P e MERS-HR2P che sono stati derivati
da MERS-CoV HR1 e HR2, rispettivamente (fig. S1C), e questi
due peptidi hanno mostrato una buona interazione tra loro (27). Qui,
abbiamo individuato la regione HR conservata di più HCoV mediante
confronti e poi sintetizzato HR1- e HR2-derivato peptidi,
denominati HR1P e HR2P (Fig. 1C). In particolare, abbiamo osservato 14-amino
inserzioni di 14 aminoacidi sia in HR1P che HR2P negli HR di due -HCoV,
cioè 229E e NL63.
Per valutare sistematicamente le attività inibitorie di questi peptidi
contro diversi HCoV, abbiamo sviluppato più test di fusione cellula-cellula
che erano mediate dalla proteina S di vari HCoV (fig.
S1D). Coerentemente con i risultati precedenti, MERS-HR2P aveva un’attività inibitoria
attività contro la fusione cellula-cellula mediata dalla proteina S di MERS-CoV
con una concentrazione per l’inibizione del 50% (IC50) di 1,01 M, mentre
ha mostrato poca attività inibitoria in altri test di fusione cellula-cellula mediata da HCoV S anche con concentrazioni fino a 5 M (Fig. 1D e
tabella S1). Allo stesso modo, SARS-HR2P ha inibito specificamente la fusione cellula-cellula mediata da SARS-CoV
S-mediata dalla fusione cellula-cellula con un IC50 di 0,52 M. D’altra parte
d’altra parte, i peptidi HR2P derivati dai due -HCoV, cioè 229E e
NL63, hanno mostrato una potente e ampia attività inibitoria contro il -HCoV
S-mediata dalla fusione cellula-cellula con valori IC50 che vanno da 0,13 a
0,51 M o da 0,21 a 0,56 M, rispettivamente, ma nessuna efficace
attività inibitoria contro gli -HCoV (compresi MERS-CoV,
SARS-CoV, e OC43) la fusione mediata da S (Fig. 1D e tabella S1).
OC43-HR2P ha mostrato un’ampia e potente attività inibitoria della fusione
con valori IC50 di 0,39, 0,54 e 0,66 M contro MERS-CoV,
SARS-CoV, e OC43, rispettivamente (Fig. 1D e tabella S1). Inaspettatamente, OC43-HR2P, un peptide -HCoV HR2-derivato, e quindi
14 residui più corti di 229E-HR2P e NL63-HR2P, ha mostrato
un’attività efficace contro gli -HCoV con un IC50 di 0,84 M su
229E-S sulla fusione cellula-cellula mediata e un IC50 di 0,94 M su NL63-S-

fusione cellula-cellula edificata. Tra tutte le HR1P, solo 229E-HR1P ha mostrato moderati effetti inibitori sulla fusione cellula-cellula mediata da 229E-S e NL63-S (Fig. 1D).
fusione cellula-cellula (Fig. 1D). Quindi, rispetto agli HR1P, tutti i peptidi HCoV
I peptidi derivati dall’HR2 hanno mostrato un’eccellente attività inibitoria auto-specifica della fusione, mentre l’OC43-HR2P ha mostrato un ampio spettro
e potente attività inibitoria di fusione sia contro -HCoV che
-HCoV S-mediata dalla fusione cellula-cellula (Fig. 1D e tabella S1). Abbiamo anche
misurato la -elicità di OC43-HR2P e HCoV-HR1Ps mediante dicroismo circolare e abbiamo scoperto che i peptidi da soli mostravano una limitata
-helicity che vanno da 11,3 a 42,3% (fig. S1E). Al contrario, le
miscele di OC43-HR2P e ciascuno di questi peptidi HR1, rispettivamente, esibito alta -helicity (70,9 a 86,7%) con temperatura di transizione di fusione (Tm) valori che variavano da 48,5 ° a 91,5 ° C
(fig. S1E), implicando ulteriormente che OC43-HR2P può legare HR1s di
diversi HCoV e formare complessi stabili, bloccando così
fusione mediata dalla proteina S.

(6)

EK1, a modified OC43-HR2P peptide, has improved fusion
inhibitory activity and increased solubility
It was previously reported that introduction of negatively and positively charged amino acids Glu (E) and Lys (K), at the i to i + 3 or i
to i + 4 positions in a helix, into an HIV-1 fusion inhibitory peptide
can form intramolecular E–K or K–E salt bridges that result in substantial enhancement of the peptide’s stability, solubility, and antiviral activity (30, 31). Using a similar design, we further optimized
the sequence of OC43-HR2P by introducing Glu or Lys at appropriate
sites in the peptide to increase the solubility and thereby the antiviral
activity of the peptide. Moreover, on the basis of the structure of
MERS-CoV S 6-HB, we also introduced mutations at some sites that
are not expected to be involved in HR1 binding, such as 4Q, 14Y,
32D, and 36L, to further enhance the fusion inhibitory activity of
the peptide (table S2). Among the series of optimized peptides, peptides EK0-1, EK0-2, EK0-3, and EK1 showed gradually increased
solubility and excellent inhibitory activity in cell-cell fusion assays.
The final peptide, EK1, exhibited the most potent pan-CoV antiviral
fusion activity with IC50 values in the range of 0.19 to 0.62 M (table
S2). In some HCoV cell-cell fusion assays, EK1 exhibited even more
effective inhibitory activity than the autologous peptide, such as
MERS-HR2P and SARS-HR2P. Akin to its ancestor OC43-HR2P,
EK1, which is derived from the short 6-HB fusion core of OC43, was
also able to potently inhibit the cell-cell fusion mediated by 229E and
NL63 S proteins, both of which harbor the long fusion core. These
results further underscore the broad-spectrum anti-HCoV potential
of EK1 (Fig. 2, A to E, and table S2). Furthermore, EK1 also had
superior pharmaceutical properties and solubility in phosphatebuffered saline (PBS) and water, which increased by 478-fold and
3.5-fold, respectively, as compared to the original OC43-HR2P.
Together, these results establish an important framework and platform for subsequent development of EK1 as a potential therapeutic
(table S2)

traduzione di (6)

EK1, un peptide OC43-HR2P modificato, ha una migliore
attività inibitoria e una maggiore solubilità
E ‘stato precedentemente segnalato che l’introduzione di negativamente e positivamente caricato aminoacidi Glu (E) e Lys (K), al i a i + 3 o i
a i + 4 posizioni in un’elica, in un peptide inibitorio di fusione HIV-1
può formare intramolecolare E-K o K-E ponti di sale che si traducono in un sostanziale miglioramento della stabilità del peptide, solubilità e attività antivirale (30, 31). Utilizzando un design simile, abbiamo ulteriormente ottimizzato
la sequenza di OC43-HR2P introducendo Glu o Lys in appropriate
siti nel peptide per aumentare la solubilità e quindi il antivirale
attività del peptide. Inoltre, sulla base della struttura di
MERS-CoV S 6-HB, abbiamo anche introdotto mutazioni in alcuni siti che
non dovrebbero essere coinvolti nel legame con HR1, come 4Q, 14Y,
32D, e 36L, per migliorare ulteriormente l’attività inibitoria della fusione
il peptide (tabella S2). Tra la serie di peptidi ottimizzati, i peptidi EK0-1, EK0-2, EK0-3, e EK1 hanno mostrato un graduale aumento
solubilità ed eccellente attività inibitoria nei saggi di fusione cellula-cellula.
Il peptide finale, EK1, ha esibito il più potente antivirale Pan-CoV
attività di fusione con valori IC50 nella gamma di 0,19 a 0,62 M (tabella
S2). In alcuni saggi di fusione cellula-cellula dell’HCoV, EK1 ha esibito un’attività inibitoria ancora più
efficace attività inibitoria rispetto al peptide autologo, come
MERS-HR2P e SARS-HR2P. Come il suo antenato OC43-HR2P,
EK1, che è derivato dal breve nucleo di fusione 6-HB di OC43, è stato
anche in grado di inibire potentemente la fusione cellula-cellula mediata da 229E e
NL63 S, che ospitano entrambe il nucleo di fusione lungo. Questi
risultati sottolineano ulteriormente il potenziale anti-HCoV ad ampio spettro
di EK1 (Fig. 2, da A a E, e tabella S2). Inoltre, EK1 aveva anche
proprietà farmaceutiche superiori e solubilità in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e acqua, che è aumentata di 478 volte e
3,5 volte, rispettivamente, rispetto all’originale OC43-HR2P.
Insieme, questi risultati stabiliscono un quadro importante e una piattaforma per il successivo sviluppo di EK1 come potenziale terapeutico
(tabella S2)

(7)

EK1 peptide potently inhibits multiple CoV cell-cell fusion
and blocks various pseudotyped and live CoV infection
SL-CoVs, including WIV1, Rs3367, and SHC014 CoVs, all manifest
potential for human infection (9–11). To further assess the breadth
of fusion inhibitory activity, as demonstrated by EK1, we established cell-cell fusion assays mediated by the S protein of these
SL-CoVs (fig. S2). Notably, many studies have suggested diversity in
the receptor-binding motif (RBM) of SL-CoV’s RBD (9–11), which

plays an important role in binding the cellular receptor and serves
as an effective target site for the development of CoV-specific antibodies or vaccines (32). Specifically, the RBM of SHC014 CoV has
only 80% similarity and 64% identity to that of SARS-CoV, and an
antibody targeting the SARS-CoV RBD could not prevent infection
mediated by the SHC014 S protein (9–11, 17). In contrast, the HR1
and HR2 sequences of SL-CoV are 100% identical to those of SARSCoV (fig. S2B). Correspondingly, EK1 exhibited greater inhibitory
activity than the autologous peptide SARS-HR2P against cell-cell
fusion mediated by the S protein of the three SL-CoVs tested
(Fig. 2, F to H), while an EK1-scrambled peptide showed no inhibitory activity on cell-cell fusion mediated by any of these CoV S
proteins (Fig. 2, A to H).
The pseudovirus assay is a good model to mimic the process of
virus entry into the target cell and has been widely used in previous
studies to assess the inhibitory activity of antiviral agents against
related CoV infection (33). We also used here pseudovirus assays to
assess the inhibitory activity of EK1 against different pseudotyped
HCoVs. In a MERS-CoV pseudovirus infection assay, both EK1 and
MERS-HR2P showed inhibitory activity with IC50 values of 0.26
and 1.06 M, respectively (Fig. 2I). Similarly, EK1 and SARS-HR2P

also effectively blocked SARS-CoV pseudovirus infection with IC50
values of 2.23 and 2.81 M, respectively (Fig. 2J). Meanwhile, EK1
demonstrated antiviral activity against pseudotyped 229E, NL63,
and OC43 infection with IC50 values of 3.35, 6.02, and 1.81 M, respectively (Fig. 2, K to M). Consistent with the results from cell-cell
fusion assays, both EK1 and SARS-HR2P inhibited pseudotyped
Rs3367 virus infection with IC50 values of 2.25 and 3.05 M, respectively, and prevented WIV1 pseudovirus infection with IC50 values
of 2.10 and 2.73 M, respectively (Fig. 2, N and O). In contrast, EK1
exhibited no inhibitory activity against VSV-G–mediated viral
infection (Fig. 2P). The EK1-scrambled peptide showed no
inhibitory activity on infection by any of these pseudoviruses
(Fig. 2, I to P). As previously reported (10), we failed to assemble
a pseudotyped SHC014 and thus did not perform pseudovirus infection assays on this virus. Collectively, pseudovirus infection by
all HCoVs and SL-CoVs could be efficiently blocked by EK1, further indicating that EK1 has broad-spectrum antiviral activity
against infection by pan-HCoVs, including -HCoVs, -HCoVs,
and SL-CoVs.
Blam-Vpr assay is a sensitive model to characterize the inhibitory
mechanism and activity of antiviral agents on virus–cell membrane

[…]

DISCUSSION
No effective and broad-spectrum anti-HCoVs drugs or vaccines are
currently available in the clinic. Notwithstanding, the RBD of the
S protein has been proposed as a promising target for the develop

ment of specific antibodies and vaccines (39, 40). For example, the
RBD-specific antibody CDC2-C2 exhibits inhibitory activity against
MERS-CoV infection. Nevertheless, administration of the
single-antibody CDC2-C2 could result in the emergence of escape mutations in MERS-CoV RBD (41). Unfortunately, the
CoV S RBD is hypervariable throughout evolution, which has
led to marked difference in host receptor usage in different
HCoVs. Even when the same host receptor is used by different
HCoVs, they frequently target different binding sites on the
host receptor (42). Therefore, specific RBD-targeting antibodies
or vaccines inevitably lack broad-spectrum activity against
HCoV infection. For example, Menachery et al. (9) found that a
SARS-CoV RBD-specific antibody could not protect mice from
infection by the chimeric virus with the SHC014 S proteins,
although SHC014 has high homology with SARS-CoV and can
bind the same host receptor ACE2. The lag time between emerging human CoV outbreaks and development of new prophylactic
treatments or vaccines is of concern. Thus, there is an urgent need
for the development of new, broad-spectrum drugs that
target conserved sites in currently circulating and future emerging
HCoVs so as to prepare for future outbreaks of yet unknown
HCoVs

In the early 1990s, a series of peptides derived from the HIV-1
gp41 HR2 (or CHR) domain, such as SJ-2176 (19), DP-178 (later
T20) (20), and C34 (21), were reported to have highly potent inhibitory activity against HIV-1 gp41-mediated membrane fusion and
HIV-1 infection with IC50 values at low nanomolar levels. Subsequently, numerous virus fusion inhibitory peptides overlapping the
HR2 sequences of class I membrane fusion proteins from other
enveloped viruses, including RSV (22), Ebola virus (23), paramyxoviruses SV5 (24), and Nipah virus (25), were also reported. In 2003,
Bosch et al. (26) discovered that a soluble HR2 peptide derived from
the MHV S protein HR2 region inhibited virus cell entry, suggesting

that the S glycoprotein of CoV is a class I fusogen with the ability to
form 6-HB during the S protein–mediated membrane fusion process. In 2004, the Bosch (43) and Jiang (18) groups independently
reported that peptides derived from the HR2 region of SARS-CoV S
protein could interact with the peptides from its HR1 region to form
6-HB and inhibited SARS-CoV S protein–mediated membrane
fusion and SARS-CoV infection with moderate potency. In 2014,
Lu et al. (27) reported that peptide derived from the MERS-CoV
S-HR2 could competitively inhibit 6-HB formation, thereby preventing fusion of the virus with host cells.
In our previous studies, we found that the MERS-CoV–specific
fusion inhibitor MERS-HR2P could not block SARS-CoV pseudovirus infection and did not display any broad-spectrum inhibitory
activity. Thus, it was unclear whether 6-HB was a good target site
for the development of a broad-spectrum anti-HCoV inhibitor. To
identify a pan-HCoV fusion inhibition target site and preferably also
to develop a potential pan-HCoV inhibitor against infection of
multiple HCoVs in the human respiratory tract, we successfully
established multiple HCoV S-mediated cell-cell fusion assays to determine the cross-inhibitory spectrum between HR1Ps and HR2Ps,
which are derived from the HR1 and HR2, respectively, of HCoVs.
Unexpectedly, we found that OC43-HR2P harbored broad-spectrum
binding activity to all HR1Ps and manifested fusion inhibitory
activity against all HCoV S-mediated cell-cell fusion. We then further
optimized the OC43-HR2P to improve its antiviral activity and
solubility. The optimized peptide EK1 exhibited broad and potent
fusion inhibitory activity against infection by HCoVs and SL-CoVs
on various in vitro models, i.e., cell-cell fusion assays and pseudotyped or live viral infection assays. We assessed the prophylactic and
protective effects of EK1 through intranasal administration on OC43
and MERS-CoV mouse models. EK1 exhibited effective preventive
and protective effects in these mouse models with an acceptable in
vivo safety profile. Furthermore, the in vivo pharmacokinetic profiling and safety studies helped us acquire useful data for potential
human clinical trials in the future.
The potency of HR2-derived peptides in inhibiting corresponding
virus-cell fusion varies significantly. For example, anti–HIV-1 peptide
T20 is about 900-fold more potent than the anti–SARS-CoV peptide SC-1, yet only 30-fold more potent than the anti–MERS-CoV
peptide HR2P (18, 27, 44). It is known that HIV-1 and SARS-CoV
each enter their target cells mainly through plasma and endosomal
membrane fusion, respectively, while MERS-CoV could infect its
target cells via both plasma and endosomal membrane fusion
(18, 27, 44). The vast differences seen in potency thus suggest that
only a limited number of the EK1 peptides can get into the endosome to inhibit virus-cell fusion. Therefore, increasing the cell permeability of the fusion inhibitory peptides is expected to enhance
the potency of these peptides. We have recently reported that addition of hydrocarbon stapling or a palmitic acid group (C16) to the
MERS-CoV fusion inhibitory peptides significantly improves
their antiviral potency and pharmacokinetic properties (45, 46).
In the near future, we will use the similar approaches to improving
the antiviral activity of EK1

Recent studies have reported that several emerging SL-CoVs,
including WIV1, SHC014, and Rs3367, have the potential to infect
humans with high virulence by further evolution or direct gene
recombination with SARS-CoV (9, 11). We found that the HR sequences of these SL-CoVs are the same as those of SARS-CoV, and
we predicted that EK1 could prevent infection by these SL-CoVs. As

expected, EK1 efficiently inhibited SL-CoV S protein–mediated cellcell fusion. Consistent with previous studies (9, 11), we herein also
failed to establish a SHC014 pseudovirus using an HIV-1 backbone
vector; therefore, we assessed the antiviral effect of EK1 only on
WIV1 and Rs3367 pseudovirus infection and found that EK1 exhibited effective inhibitory activity against these two SL-CoVs. In
addition, some animal CoVs within the CoV family are very close to
HCoV, such as bovine coronavirus (BCoV) and MHV. The HR sequences of these CoVs are very similar to those of OC43, indicating
that peptide EK1 will likely also be effective on these viruses.
One intriguing question is why only EK1 and the HR2 from
OC43 manifested “pan-CoV” inhibitory activity, while HR2 from
other HCoVs did not. HR2s from -HCoVs are substantially longer
than those from -HCoVs (Fig. 1C), and docking of HR2s from
229E and NL63 onto the 3HR1 cores of -HCoVs resulted in severe
steric clashes (figure not shown). It is thus understandable why the
HR2s from 229E and NL63 would not have broad-spectrum activity
toward -HCoVs (Fig. 1D).
At the same time, sequence alignment between EK1 and HR2s
from OC43, SARS-CoV, and MERS-CoV provided clues on the very
limited inhibition breadth of SARS-HR2 and MERS-HR2. Although
most residues that mediated hydrophobic (shaded orange and yellow)
and side chain–to–side chain hydrophilic interactions (boxed in cyan)
are conserved between EK1 and different HR2s, sequence variability
does exist at positions V7, Y30, and some other ridge-packing residues (fig. S7A). We thus focused our analysis on these residues and
their surrounding environments in different HCoVs’ 3HR1 cores. In
both solved structures of MERS(HR1)-EK1 and SARS(HR1)-EK1,
V7EK1 fits its side chain neatly into the hydrophobic pockets on these
two 3HR1 cores (fig. S7B, second and fourth panels). Nevertheless,
in the previously reported structure of the SARS-CoV fusion core,
A1156SARS, the equivalent of V7EK1 in SARS-CoV, would occupy the
same cavity loosely (fig. S7B, third panel), while T1257MERS, the
equivalent of V7EK1 in MERS-CoV, could not fully bury its side
chain owing to the polar nature of the Thr residue (fig. S7B, first
panel). Thus, Val, in EK1 and OC43-HR2, is more effective in fitting
the hydrophobic cavities at this position than Ala (seen in SARSHR2) or Thr (seen in MERS-HR2) (fig. S7B)

In total, we observed four ridge-packing interactions between the
EK1 and 3HR1 cores. The ridge to which S29Y30EK1 binds is surrounded by polar and positively charged residues in MERS-CoV and
SARS-CoV but surrounded by polar and negatively charged residues
in 229E [fig. S7C (top panel), side chains of surrounding residues
are shown as stick models]. At this position, the polar pair “Ser-Tyr”
in EK1 and OC43-HR2 appears to be more suitable than the “Ser-Leu”
pair from SARS-HR2 in accommodating the opposite electrostatic environments in different HCoVs. Moreover, the aromatic ring
of Tyr could also form additional polar interactions with HR1 side
chains in different HCoVs (Fig. 6A). Likewise, the ridges to which
E15M16EK1 binds also exhibited better shape complementarity to
Met (in EK1 and OC43-HR2) than to Ile (in SARS-HR2). Collectively, it seems that EK1 and OC43-HR2 have more optimal amino
acid choices at all the abovementioned critical positions, which likely
accounts for their unique pan-CoV inhibitory activity.
In its natural state, the S protein that is present on the CoV surface
is inactive. After receptor binding target cell proteases activate the S
protein by cleaving the exposed enzyme target sites, leaving the S2
subunit free to mediate viral fusion and entry. CoV can enter the
target cell via two pathways: one is the endocytosis pathway and the

other is direct fusion on the cellular surface. For example, when
SARS-CoV enters the target cell through the endocytosis pathway, its
S protein can be cleaved and activated by the pH-dependent cysteine
protease cathepsin L in the endosome. On the other hand, recent
studies have consistently reported that the SARS-CoV S protein can
also be cleaved and activated by transmembrane protease serine 2
(TMPRSS2) and human airway trypsin-like protease, which are
located on the cell surface, thus activating and allowing the S protein
to mediate SARS-CoV infection at the plasma membrane (9–11). In
accord with such a finding, Matsuyama et al. (47) reported that the
HR2 peptide efficiently inhibited SARS-CoV entry into cells, while
lysosome-tropic reagents failed to inhibit at all. Similarly, TMPRSS2
also has the capacity to promote the entry of MERS-CoV through
bypassing the endocytosis pathway and directly activating its S protein on the cellular surface (48). Recently, several studies have reported
that TMPRSS2 is highly expressed on human respiratory epithelial
cells surface and was even associated with several CoV receptors,
such as ACE2 and DPP4 (48–50). Hence, the plasma membrane
fusion pathway seems a preferred choice for HCoV infection in the
human respiratory tract. Consistently, our previous study found that
MERS-CoV–specific fusion inhibitor HR2PM2 effectively inhibited
MERS-CoV infection in vivo by intranasal administration (33). Other
studies have also reported that the current clinical isolates of 229E
and OC43 are very sensitive to cell surface TMRRSS2 but not to endosomal cathepsins (51, 52). Overall, for current circulating HCoVs or
emerging HCoVs, the cell surface fusion pathway in human respiratory tract would appear to be very important. Therefore, peptide
fusion inhibitors and the strategy of intranasal administration are
excellent choices for preventing HCoV infection via the airway,
which is a key site for HCoV to rapidly establish infection and widely
spread to other organs

Currently, circulating HCoVs pose a potential threat to humans;
moreover, it is almost certain that other zoonotic CoVs will be transmitted to humans in the future. The availability of HCoV-specific
drugs with broad-spectrum inhibitory activity is therefore important
for the prevention and control of a future HCoV epidemic. The EK1
fusion inhibitor peptide targeting the conserved site in the spike HR1,
but not the hypervariable RBD region, has potent and broad inhibitory activity against multiple HCoV infections. EK1 through nasal
administration exhibited effective and broadly anti-HCoV activity
with a satisfactory safety profile in vivo. Hence, EK1 is a promising
candidate for further development as an antiviral agent against
infection of multiple HCoVs, especially for use in infants and the
elderly, as well as immunocompromised patients, who would be more
vulnerable to HCoV infections (53–56). Meanwhile, this study provides clues and methods for the development of peptide fusion inhibitors with potency and breadth in inhibiting infections by other
highly pathogenic enveloped viruses with class I membrane fusion
proteins, such as Ebola and Marburg viruses, Hendra and Nipah
viruses, and influenza viruses

traduzione di (7)

Il peptide EK1 inibisce potentemente la fusione cellula-cellula di più CoV
e blocca varie infezioni da CoV pseudotipati e vivi
SL-CoVs, tra cui WIV1, Rs3367, e SHC014 CoVs, tutti manifesti
potenziale di infezione umana (9-11). Per valutare ulteriormente l’ampiezza
dell’attività inibitoria della fusione, come dimostrato da EK1, abbiamo stabilito saggi di fusione cellula-cellula mediati dalla proteina S di questi
SL-CoVs (fig. S2). In particolare, molti studi hanno suggerito la diversità
il motivo di legame al recettore (RBM) della RBD di SL-CoV (9-11), che

gioca un ruolo importante nel legare il recettore cellulare e serve
come un sito bersaglio efficace per lo sviluppo di anticorpi o vaccini specifici per il CoV (32). In particolare, l’RBM di SHC014 CoV ha
solo l’80% di somiglianza e il 64% di identità con quello del SARS-CoV, e un
un anticorpo mirato alla RBD del SARS-CoV non potrebbe prevenire l’infezione
mediata dalla proteina S di SHC014 (9-11, 17). Al contrario, le sequenze HR1
e HR2 di SL-CoV sono identiche al 100% a quelle di SARSCoV (fig. S2B). Corrispondentemente, EK1 ha esibito una maggiore attività inibitoria
attività rispetto al peptide autologo SARS-HR2P contro la fusione cellula-cellula
fusione cellula-cellula mediata dalla proteina S dei tre SL-CoV testati
(Fig. 2, da F a H), mentre un peptide EK1-crambled non ha mostrato alcuna attività inibitoria sulla fusione cellula-cellula mediata da nessuna di queste proteine S
(Fig. 2, da A a H).
Il saggio pseudovirus è un buon modello per imitare il processo di
ingresso del virus nella cellula bersaglio ed è stato ampiamente utilizzato in precedenti
studi per valutare l’attività inibitoria degli agenti antivirali contro
l’infezione da CoV correlata (33). Abbiamo anche usato qui saggi di pseudovirus per
valutare l’attività inibitoria di EK1 contro diversi pseudotipi
HCoV. In un test di infezione da pseudovirus MERS-CoV, sia EK1 che
MERS-HR2P hanno mostrato attività inibitoria con valori IC50 di 0,26
e 1,06 M, rispettivamente (Fig. 2I). Allo stesso modo, EK1 e SARS-HR2P

hanno anche bloccato efficacemente l’infezione da pseudovirus SARS-CoV con valori di IC50
di 2,23 e 2,81 M, rispettivamente (Fig. 2J). Nel frattempo, EK1
ha dimostrato attività antivirale contro lo pseudovirus 229E, NL63,
e l’infezione OC43 con valori IC50 di 3,35, 6,02, e 1,81 M, rispettivamente (Fig. 2, K a M). Coerentemente con i risultati dei saggi di fusione cellula-cellula
saggi di fusione cellulare, sia EK1 che SARS-HR2P hanno inibito l’infezione del virus pseudotipato
Rs3367 con valori IC50 di 2,25 e 3,05 M, rispettivamente, e hanno impedito l’infezione dello pseudovirus WIV1 con valori IC50
di 2,10 e 2,73 M, rispettivamente (Fig. 2, N e O). Al contrario, EK1
non ha mostrato alcuna attività inibitoria contro VSV-G-mediata virale
virale (Fig. 2P). Il peptide EK1-crambled non ha mostrato
attività inibitoria sull’infezione da nessuno di questi pseudovirus
(Fig. 2, da I a P). Come precedentemente riportato (10), non siamo riusciti a montare
uno pseudotipato SHC014 e quindi non ha eseguito saggi di infezione pseudovirus su questo virus. Collettivamente, l’infezione pseudovirus da
tutti gli HCoVs e SL-CoVs potrebbe essere efficacemente bloccata da EK1, indicando ulteriormente che EK1 ha attività antivirale ad ampio spettro
contro l’infezione da pan-HCoVs, compresi -HCoVs, -HCoVs,
e SL-CoV.
Il test Blam-Vpr è un modello sensibile per caratterizzare il meccanismo inibitorio
meccanismo inibitorio e l’attività degli agenti antivirali sulla membrana virus-cellulare

[…]

DISCUSSIONE
Nessun farmaco o vaccino anti-HCoVs efficace e ad ampio spettro è
attualmente disponibili in clinica. Nonostante ciò, la RBD della proteina
proteina S è stata proposta come un bersaglio promettente per lo sviluppo

di anticorpi e vaccini specifici (39, 40). Per esempio, l’anticorpo
RBD-specifico, l’anticorpo CDC2-C2 mostra un’attività inibitoria contro
l’infezione da MERS-CoV. Tuttavia, la somministrazione del
singolo anticorpo CDC2-C2 potrebbe provocare l’emergere di mutazioni di fuga nella RBD di MERS-CoV (41). Sfortunatamente, il
CoV S RBD è ipervariabile nel corso dell’evoluzione, il che ha
portato a una marcata differenza nell’uso del recettore dell’ospite in diversi
HCoV. Anche quando lo stesso recettore dell’ospite è usato da diversi
HCoV, essi puntano spesso a diversi siti di legame sul
recettore ospite (42). Pertanto, gli anticorpi o i vaccini specifici che mirano all’RBD
o vaccini mancano inevitabilmente di attività ad ampio spettro contro
l’infezione da HCoV. Per esempio, Menachery et al. (9) hanno scoperto che un
SARS-CoV RBD-specifico non poteva proteggere i topi da
dall’infezione del virus chimerico con le proteine SHC014 S,
anche se SHC014 ha un’alta omologia con SARS-CoV e può
legare lo stesso recettore dell’ospite ACE2. Il tempo che intercorre tra i focolai di CoV umani emergenti e lo sviluppo di nuovi trattamenti profilattici
trattamenti profilattici o vaccini è preoccupante. Quindi, c’è un urgente bisogno
per lo sviluppo di nuovi farmaci ad ampio spettro che
siti conservati nei siti attualmente in circolazione e nei futuri emergenti
HCoV in modo da prepararsi a future epidemie di
HCoVs

Nei primi anni ’90, una serie di peptidi derivati dal dominio HIV-1
gp41 HR2 (o CHR), come SJ-2176 (19), DP-178 (poi
T20) (20), e C34 (21), sono stati segnalati per avere un’attività inibitoria altamente potente contro la fusione di membrana mediata da HIV-1 gp41 e
HIV-1 con valori IC50 a bassi livelli nanomolari. Successivamente, numerosi peptidi inibitori della fusione virale che si sovrappongono alle
sequenze HR2 delle proteine di fusione di membrana di classe I di altri
virus avvolti, tra cui RSV (22), virus Ebola (23), paramyxovirus SV5 (24), e virus Nipah (25), sono stati riportati. Nel 2003,
Bosch et al. (26) hanno scoperto che un peptide HR2 solubile derivato da
dalla regione HR2 della proteina S dell’MHV inibiva l’ingresso nelle cellule del virus, suggerendo

che la glicoproteina S del CoV è un fusogeno di classe I con la capacità di
formare 6-HB durante il processo di fusione di membrana mediato dalla proteina S. Nel 2004, i gruppi Bosch (43) e Jiang (18) hanno indipendentemente
hanno riferito che i peptidi derivati dalla regione HR2 della proteina S
potrebbe interagire con i peptidi della sua regione HR1 per formare
6-HB e hanno inibito la fusione di membrana mediata dalla proteina S della SARS-CoV
e l’infezione da SARS-CoV con una potenza moderata. Nel 2014,
Lu et al. (27) hanno riportato che il peptide derivato dalla S-HR2 del MERS-CoV
S-HR2 potrebbe inibire competitivamente la formazione di 6-HB, impedendo così la fusione del virus con le cellule ospiti.
Nei nostri studi precedenti, abbiamo scoperto che l’inibitore di fusione specifico per MERS-CoV
inibitore di fusione MERS-HR2P non poteva bloccare l’infezione da pseudovirus SARS-CoV e non mostrava alcuna attività inibitoria ad ampio spettro
attività. Quindi, non era chiaro se 6-HB fosse un buon sito bersaglio
per lo sviluppo di un inibitore anti-HCoV ad ampio spettro. Per
identificare un sito bersaglio per l’inibizione della fusione pan-HCoV e preferibilmente anche
sviluppare un potenziale inibitore pan-HCoV contro l’infezione di
HCoV multipli nel tratto respiratorio umano, abbiamo stabilito con successo
stabilito molteplici saggi di fusione cellula-cellula mediata da HCoV S per determinare lo spettro di inibizione incrociata tra HR1Ps e HR2Ps,
che derivano rispettivamente dalle HR1 e HR2 degli HCoV.
Inaspettatamente, abbiamo scoperto che OC43-HR2P aveva un ampio spettro
attività di legame a tutte le HR1P e ha manifestato un’attività inibitoria di fusione
attività contro tutte le fusioni cellula-cellula mediate da HCoV S. Abbiamo quindi ulteriormente
ottimizzato l’OC43-HR2P per migliorare la sua attività antivirale e
solubilità. Il peptide ottimizzato EK1 ha mostrato un’ampia e potente
attività inibitoria di fusione contro l’infezione da HCoVs e SL-CoVs
su vari modelli in vitro, cioè test di fusione cellula-cellula e test di infezione virale pseudotipata o viva. Abbiamo valutato gli effetti profilattici e
effetti protettivi di EK1 attraverso la somministrazione intranasale su modelli di topi OC43
e su modelli di topi MERS-CoV. EK1 ha esibito efficaci effetti preventivi
ed effetti protettivi in questi modelli murini con un accettabile in
profilo di sicurezza in vivo accettabile. Inoltre, il profilo farmacocinetico in vivo e gli studi di sicurezza ci hanno aiutato ad acquisire dati utili per potenziali
studi clinici sull’uomo in futuro.
La potenza dei peptidi derivati da HR2 nell’inibire la corrispondente
fusione virus-cellula varia significativamente. Per esempio, il peptide anti-HIV-1
T20 è circa 900 volte più potente del peptide SC-1 anti-SARS-CoV, ma solo 30 volte più potente del peptide HR2P anti-MERS-CoV
HR2P (18, 27, 44). È noto che l’HIV-1 e il SARS-CoV
entrano nelle loro cellule bersaglio principalmente attraverso la fusione della membrana plasmatica ed endosomiale
rispettivamente, mentre MERS-CoV potrebbe infettare le sue
cellule bersaglio sia attraverso la fusione della membrana plasmatica che endosomiale
(18, 27, 44). Le grandi differenze osservate nella potenza suggeriscono quindi che
solo un numero limitato di peptidi EK1 può entrare nell’endosoma per inibire la fusione virus-cellula. Pertanto, aumentando la permeabilità cellulare dei peptidi inibitori della fusione ci si aspetta di aumentare
la potenza di questi peptidi. Abbiamo recentemente riportato che l’aggiunta di graffette idrocarburiche o di un gruppo di acido palmitico (C16) alla
peptidi inibitori della fusione di MERS-CoV migliora significativamente
la loro potenza antivirale e le proprietà farmacocinetiche (45, 46).
Nel prossimo futuro, useremo approcci simili per migliorare
l’attività antivirale di EK1

Studi recenti hanno riportato che diversi SL-CoV emergenti,
tra cui WIV1, SHC014 e Rs3367, hanno il potenziale di infettare
con un’alta virulenza attraverso un’ulteriore evoluzione o una ricombinazione genica diretta
ricombinazione genica diretta con il SARS-CoV (9, 11). Abbiamo scoperto che le sequenze HR di questi SL-CoV sono le stesse di quelle del SARS-CoV, e
abbiamo previsto che l’EK1 potrebbe prevenire l’infezione da questi SL-CoV. Come

atteso, EK1 ha inibito efficacemente la fusione cellulare mediata dalla proteina S di SL-CoV. Coerentemente con gli studi precedenti (9, 11), abbiamo anche
non siamo riusciti a stabilire uno pseudovirus SHC014 usando un vettore HIV-1
vettore; pertanto, abbiamo valutato l’effetto antivirale di EK1 solo su
WIV1 e Rs3367 pseudovirus infezione e trovato che EK1 esibito efficace attività inibitoria contro questi due SL-CoV. In
Inoltre, alcuni CoV animali della famiglia CoV sono molto vicini a
HCoV, come il coronavirus bovino (BCoV) e MHV. Le sequenze HR di questi CoV sono molto simili a quelle di OC43, indicando
che il peptide EK1 sarà probabilmente efficace anche su questi virus.
Una domanda intrigante è perché solo EK1 e l’HR2 di
OC43 hanno manifestato un’attività inibitoria “pan-CoV”, mentre l’HR2 di
altri HCoV no. Gli HR2 degli -HCoV sono sostanzialmente più lunghi
di quelli da -HCoV (Fig. 1C), e il docking di HR2 da
229E e NL63 sui nuclei 3HR1 di -HCoVs ha portato a gravi
scontri sterici (figura non mostrata). È quindi comprensibile perché gli
HR2s da 229E e NL63 non avrebbe attività ad ampio spettro
verso -HCoVs (Fig. 1D).
Allo stesso tempo, l’allineamento di sequenza tra EK1 e HR2
da OC43, SARS-CoV, e MERS-CoV ha fornito indizi sulla molto
limitata ampiezza di inibizione di SARS-HR2 e MERS-HR2. Sebbene
la maggior parte dei residui che hanno mediato l’idrofobia (ombreggiati in arancione e giallo)
e le interazioni idrofile da catena laterale a catena laterale (in ciano)
sono conservati tra EK1 e diversi HR2, la variabilità di sequenza
esiste nelle posizioni V7, Y30, e alcuni altri residui di ridge-packing (fig. S7A). Abbiamo quindi focalizzato la nostra analisi su questi residui e
i loro ambienti circostanti nei diversi nuclei 3HR1 degli HCoV. In
entrambe le strutture risolte di MERS(HR1)-EK1 e SARS(HR1)-EK1,
V7EK1 si adatta perfettamente alla sua catena laterale nelle tasche idrofobiche di questi
due nuclei 3HR1 (fig. S7B, secondo e quarto pannello). Tuttavia,
nella struttura precedentemente riportata del nucleo di fusione SARS-CoV,
A1156SARS, l’equivalente di V7EK1 in SARS-CoV, occuperebbe la
stessa cavità in modo lasco (fig. S7B, terzo pannello), mentre T1257MERS, l’equivalente di
equivalente di V7EK1 in MERS-CoV, non potrebbe seppellire completamente la sua catena
a causa della natura polare del residuo Thr (fig. S7B, primo
pannello). Così, Val, in EK1 e OC43-HR2, è più efficace nell’adattare
le cavità idrofobiche in questa posizione che Ala (visto in SARSHR2) o Thr (visto in MERS-HR2) (fig. S7B)

In totale, abbiamo osservato quattro interazioni di ridge-packing tra i nuclei
EK1 e i nuclei 3HR1. La cresta a cui si lega S29Y30EK1 è circondata da residui polari e caricati positivamente in MERS-CoV e
SARS-CoV ma è circondato da residui polari e caricati negativamente
in 229E [fig. S7C (pannello superiore), le catene laterali dei residui circostanti
sono mostrate come modelli a bastoncino]. In questa posizione, la coppia polare “Ser-Tyr”
in EK1 e OC43-HR2 sembra essere più adatta rispetto alla coppia “Ser-Leu”
di SARS-HR2 nell’accomodare gli ambienti elettrostatici opposti in diversi HCoV. Inoltre, l’anello aromatico
di Tyr potrebbe anche formare ulteriori interazioni polari con le catene laterali HR1
in diversi HCoV (Fig. 6A). Allo stesso modo, le creste a cui
E15M16EK1 si lega ha anche mostrato una migliore complementarità di forma a
Met (in EK1 e OC43-HR2) che a Ile (in SARS-HR2). Collettivamente, sembra che EK1 e OC43-HR2 abbiano scelte di aminoacidi più ottimali
scelte aminoacidiche più ottimali in tutte le posizioni critiche di cui sopra, il che probabilmente
spiega la loro unica attività inibitoria pan-CoV.
Nel suo stato naturale, la proteina S presente sulla superficie del CoV
è inattiva. Dopo il legame del recettore, le proteasi delle cellule bersaglio attivano la proteina S
scindendo i siti bersaglio esposti dell’enzima, lasciando la subunità S2
lasciando la subunità S2 libera di mediare la fusione e l’ingresso del virus. Il CoV può entrare nella
cellula bersaglio attraverso due vie: una è la via dell’endocitosi e l’altra

l’altro è la fusione diretta sulla superficie cellulare. Per esempio, quando il
SARS-CoV entra nella cellula bersaglio attraverso la via dell’endocitosi, la sua
proteina S può essere scissa e attivata dalla cisteina proteasi L, dipendente dal pH, nell’endosoma.
proteasi cisteina L nell’endosoma. D’altra parte, studi recenti
studi hanno costantemente riportato che la proteina S della SARS-CoV può
essere scissa e attivata anche dalla serina proteasi transmembrana 2
(TMPRSS2) e dalla proteasi simile alla tripsina delle vie aeree umane, che sono
che si trovano sulla superficie cellulare, attivando così e permettendo alla proteina S
di mediare l’infezione da SARS-CoV sulla membrana plasmatica (9-11). In
accordo con tale scoperta, Matsuyama et al. (47) hanno riportato che il
Il peptide HR2 ha inibito efficacemente l’ingresso di SARS-CoV nelle cellule, mentre
i reagenti lisosoma-tropici non sono riusciti a inibire affatto. Allo stesso modo, TMPRSS2
ha anche la capacità di promuovere l’ingresso di MERS-CoV attraverso
bypassando la via dell’endocitosi e attivando direttamente la sua proteina S sulla superficie cellulare (48). Recentemente, diversi studi hanno riportato
che TMPRSS2 è altamente espresso sulla superficie delle cellule epiteliali
cellule respiratorie umane ed è stato anche associato a diversi recettori di CoV,
come ACE2 e DPP4 (48-50). Quindi, la via di fusione della membrana plasmatica
sembra una scelta preferita per l’infezione da HCoV nel
tratto respiratorio umano. Coerentemente, il nostro studio precedente ha trovato che
MERS-CoV-specifico inibitore di fusione HR2PM2 ha efficacemente inibito
l’infezione da MERS-CoV in vivo mediante somministrazione intranasale (33). Altri
studi hanno anche riportato che gli attuali isolati clinici di 229E
e OC43 sono molto sensibili alla superficie cellulare TMRRSS2 ma non alle catepsine endosomiali (51, 52). Nel complesso, per gli attuali HCoV in circolazione o
HCoV emergenti, la via di fusione della superficie cellulare nel tratto respiratorio umano sembra essere molto importante. Pertanto, il peptide
inibitori di fusione peptidici e la strategia di somministrazione intranasale sono
scelte eccellenti per prevenire l’infezione da HCoV attraverso le vie respiratorie,
che è un sito chiave per l’HCoV per stabilire rapidamente l’infezione e diffondere ampiamente
diffondersi ad altri organi

Attualmente, gli HCoV in circolazione rappresentano una potenziale minaccia per gli esseri umani;
inoltre, è quasi certo che altri CoV zoonotici saranno trasmessi agli esseri umani in futuro. La disponibilità di farmaci specifici per l’HCoV
con attività inibitoria ad ampio spettro è quindi importante
per la prevenzione e il controllo di una futura epidemia di HCoV. L’EK1
peptide inibitore della fusione che prende di mira il sito conservato nel picco HR1,
ma non la regione ipervariabile RBD, ha una potente e ampia attività inibitoria contro le infezioni multiple da HCoV. EK1 attraverso la somministrazione nasale
somministrazione nasale ha mostrato un’efficace e ampia attività anti-HCoV
con un profilo di sicurezza soddisfacente in vivo. Quindi, EK1 è un candidato promettente
candidato per un ulteriore sviluppo come agente antivirale contro
l’infezione da HCoV multipli, specialmente per l’uso nei neonati e negli
anziani, così come nei pazienti immunocompromessi, che sarebbero più
vulnerabili alle infezioni da HCoV (53-56). Nel frattempo, questo studio fornisce indizi e metodi per lo sviluppo di inibitori di fusione peptidica con potenza e ampiezza nell’inibire le infezioni da altri
virus avvolti altamente patogeni con proteine di fusione di membrana di classe I
proteine di fusione della membrana di classe I, come i virus Ebola e Marburg, i virus Hendra e Nipah
e i virus dell’influenza

Commento:

Lo studio che abbiamo tradotto risale all’anno .. 2019 .. l’anno dei primi casi in Cina.

Risulta un mistero del perché sia stato sviluppato un farmaco sperimentale basato su spike anziché un farmaco basato su EK1.

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